张逸，鲁双云，高文娟，刘扬，潘立群，何红，顾海鹰
摘要:【目的】检验粘克TM可吸收医用膜是否符合生物材料的热原要求，建立粘克TM可吸收医用膜的细菌内毒素检查方法。【方法】按《中华人民共和国药典》2005年版附录及GB/16175一1996规定，同时采用热原检查法和细菌内毒素检查法对粘克TM可吸收医用膜72h的浸提液样品进行检测。【结果】该浸提液对细菌内毒检测不产生干扰，细菌内毒素试验结果为阴性。同时受试家兔体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃。【结论】粘克TM可吸收医用膜不含引起机体发热的内毒素或致热原，符合医用生物材料的使用标准。用细菌内毒素检查法替代家兔热原法对该可吸收膜进行热原检查是可行的。
关键词:粘克TM可吸收医用膜；家兔热原试验；内毒素试验
作为评价医用生物材料生物学安全性指标之一的热原试验和细菌内毒素试验是检测其是否含有引起机体发热的致热原或内毒素的方法。热原试验能够全面检出内毒素所致或非内毒素所致的热原物质，而内毒素试验是利用赏的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断样品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法。与家兔热原试验相比，它具简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。内毒素试验一般只用于某些大液体热原的检查。本文依照《中华人民共和国药典》2005年版附录XID，XIE及GB/T16175一1996的标准要求，同时用热原检查法和细菌内毒素检查法对粘克TM可吸收医用膜进行检测，研究能否用细菌内毒素试验替代家兔热原试验进行热原检测，以建立能够快速检测该可吸收医用膜内毒素的检查方法。
1材料与仪器
1.1 试剂
细菌内毒素检查用水(BET水):批号:060315规格:5
细菌内毒素工作标准品(RES):批号:2006一4 规格:160EU/支厂家:中国药品生物制品检定所
鲎试剂:批号:0602210 规格:0.25EU/ml，0.lml/支 厂家:湛江博康海洋生物有限公司。
1.2样品
粘克TM可吸收医用膜: 批号：02010406 规格:140mmx60mm，批号：03010626 规格:50mmx50mm 厂家:启东致远生物科技有限公司（即现在由上海典范医疗科技有限公司生产的粘克TM可吸收医用膜）
1.3仪器
电热恒温热鼓风干燥箱，型号:101AB-Z(上海华联环境试验设备公司恒昌仪器厂)，洁净工作台，型号:HS-1300(苏州安泰空气技术有限公司)，旋涡混合器，型号:XW-80A(上海医科大学仪器厂)。
1.4实验动物
1.9-2.8kg家兔，由南通大学实验动物中心提供。
2方法
2.1试验准备
试验所用器材，经180℃烘烤3h以上除去可能存在的外源内毒素。
2.2粘克哪可吸收医用膜浸提液的制备阁
将同一批号的粘克侧可吸收医用膜切成30mmx5mm条状，置于去热原的25ml锥形瓶中，按受试材料6cm2::1ml氯化钠注射液的比例，取14ml氯化钠注射液于锥形瓶中，置于37℃电热恒温培养箱中浸提72h。72h后将浸提液转移至另一去热原的锥形瓶中，调节pH值为7.0左右，4℃保存备用。以上过程均在洁净工作台上按无菌操作要求进行。
2.3鲎试剂灵敏度的复核
按《中华人民共和国药典》2005年版附录XIE细菌内毒素检查法复核鲎试剂灵敏度，结果见表1。所用上述批号鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，其灵敏度符合规定，可用于试验。
表一 灵敏度复核结果
|
批号 |
细菌内毒素浓度（EU/ml） |
阴性对照 |
λ |
|||
|
0.5 |
0.25 |
0.125 |
0.0625 |
|||
|
0602210 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
-- |
0.125 |
2.4干扰预试验
取医用膜浸提液，以BET水制成10倍、50倍、100倍系列稀释溶液，用此系列溶液及浸提液原液作溶剂，溶解并稀释内毒素，以制成含细菌内毒素工作标准品2入和0.25入两个浓度的内毒素溶液，用灵敏度为0.25EU/m1的赏试剂进行试验，同时作阳性和阴性对照。
2.5干扰试验
按《中华人民共和国药典》进行干扰试验。分别用BET水及浸提液原液将内毒素配制成浓度为0.5、0.25、0.125、0.0625EU/ml的溶液，同时用BET水和浸提液原液各做2管阴性对照，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行试验。
2.6样品检测
取医用膜浸提液原液，按中国药典进行内毒素检查试验。
2.7热原检查法
根据GB/T16175-1996热原试验，在试验前7d选3只家兔，雌雄不限，雌兔无孕，且测温前7d内应在同一环境条件用同一饲料饲养，在此期间家兔体重无减轻，精神、食欲、排泄等无异常。预测体温时用肛温计插人家兔肛门，深度约6cm，时间为2min，取出肛温计并记下读数。每隔lh测量1次，共测4次，体温均在38.0℃-39.6℃的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4℃，符合热原试验要求。
3d后将家兔固定于固定器内。30min后开始第1次测量，以后每隔30min测1次，共测3次。体温之差不超过0.2℃，以此3次体温的平均值为该兔的正常体温。且当日使用家兔的体温在38.0℃一39.6℃的范围内，各兔间正常体温之差不超过1℃。在家兔正常体温符合要求后15min内，自耳静脉缓慢注人预热38℃医用膜浸提液，剂量为10m/kg。注射后每隔lh测量体温1次，3次体温中最高的1次减去正常体温为试验家兔体温升高值，结果见表4。
3结果与讨论
该医用膜浸提液的原液和稀释10倍、50倍、100倍液对细菌内毒素试验均不产生干扰作用(见表2)。用原液做干扰试验，得到誉试剂Es值为0.125，在0.5λ~2λ范围内。Et分别为0.18和0.125，在0.5-2.OEs范围内，因此认为医用膜的浸提原液对内毒素试验不产生干扰(见表3)。
表二 干扰预试验的测定结果
|
样品批号 |
系列 |
稀释倍数 |
阳性对照 |
阴性对照 |
|||
|
原液 |
10倍 |
50倍 |
100倍 |
||||
|
02010406 |
样品阴性对照 |
-- |
-- |
-- |
-- |
++ |
-- |
|
样品阳性对照 |
++ |
++ |
++ |
++ |
|||
|
03010626 |
样品阴性对照 |
-- |
-- |
-- |
-- |
++ |
-- |
|
样品阳性对照 |
++ |
++ |
++ |
++ |
|||
表三干扰试验结果
|
样品批号 |
系列 |
细菌内毒素浓度（EU/ml |
阳性对照 |
阴性对照 |
灵敏度E（EU/ml） |
|||
|
0.5 |
0.25 |
0.125 |
0.0625 |
|||||
|
|
BET水 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
++ |
-- |
0.125 |
|
02010406 |
样品 |
++++ |
++++ |
+--+ |
---- |
++ |
-- |
0.18 |
|
03010626 |
样品 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
++ |
-- |
0.125 |
表四可吸收医用膜细菌内毒素检查结果
|
样品批号 |
样品管 |
样品阳性对照管（2λ） |
阴性对照管 |
阳性对照管（2λ） |
|
02010406 |
-- |
++ |
-- |
++ |
|
03010626 |
-- |
++ |
-- |
++ |
通过表4的内毒素检查结果可见该医用膜的细菌内毒素检查是符合规定的。同时用家兔进行热原试验，由表5可见，3只家兔体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃，热原检查符合规定，与细菌内毒素检查法结果一致。
表五 热原试验结果
|
批号 |
兔号 |
体重 （kg） |
注射前体温（℃） |
注射前体温（℃） |
体温升高值 |
结论 |
||||
|
第1次 |
第2次 |
第3次 |
第1次 |
第2次 |
第3次 |
|||||
|
02010406 |
1 |
2.6 |
39.5 |
39.5 |
39.6 |
39.6 |
39.5 |
39.6 |
0.1 |
合格 |
|
2 |
2.4 |
39.4 |
39.5 |
39.5 |
39.5 |
39.4 |
39.5 |
0.0 |
||
|
3 |
2.3 |
39.1 |
39.1 |
39.1 |
39.4 |
39.4 |
39.2 |
0.3 |
||
|
03010626 |
1 |
2.4 |
39.2 |
39.2 |
39.2 |
39.4 |
39.2 |
39.4 |
0.2 |
合格 |
|
2 |
2.3 |
39.5 |
39.5 |
39.3 |
39.2 |
39.2 |
39.1 |
0.0 |
||
|
3 |
2.4 |
39.4 |
39.3 |
39.3 |
39.2 |
39.1 |
39.2 |
0.0 |
||
4结论
本试验同时用细菌内毒素检查法和热原检查法检查粘克哪可吸收医用膜是否含有引起机体发热的内毒素或致热原。两种方法的检查结果一致，均为阴性，因此判定该医用膜不含引起机体发热的内毒素或致热原，符合医用材料的使用标准。同时说明用细菌内毒素检查法替代家兔热原法对该可吸收医用膜进行热原检查是可行的。
参考文献:
【1】中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社，2005.附录XIE，85一88.
【2】中国标准出版社第一编辑室.GB理16175一1996医用有机硅材料生物学评价试验方法[S].北京:中国标准出版社，2003:热原试验，16一17.
【3】中国标准出版社第一编辑室.GB理16886.12一20(X]医疗器械生物学评价[S].北京:中国标准出版社，2003:第12部:样品制备与参照样品，191一192.
(收稿日期:2006-11-20)
选自《现代预防医学》2007年第34卷第18期